Práctica: Dilución seriada

Fundamento
  
  Las diluciones seriadas son bancos de diluciones en las que la sustancia a disolver se va trasvasando de tubo a tubo hasta conseguir la dilución deseada. Este procedimiento es útil en las pruebas de anticuerpos, de reconocimiento, y otras muchas pruebas microbiológicas.

Material

- Matraz aforado de 100 ml
- 4 tubos de ensayo
- Micropipeta con varias boquillas
- Agitador
- Agua destilada
- Azul de metileno
- Gradilla
- Pipeta de 5 ml



Cálculos

Primeramente se hace un esquema del banco de diluciones seriadas:

  A continuación, mediante la fórmula del factor de dilución hallamos la concentración final de cada tubo, y mediante la fórmula de diluciones seriadas hallamos el volumen que hay que trasvasar de tubo a tubo, y el volumen que hay que desechar del último (la misma cifra)

Procedimiento

- En una gradilla se colocan los cuatro tubos de ensayo.

- Se echan con una pipeta 5 ml de agua destilada en cada tubo.

- Con la micropipeta se trasvasan 0,55 ml de la disolución madre al tubo 1 (se debe cambiar la punta de la pipeta al trasvasar a cada tubo). Después se homogeneiza el tubo con el agitador.

- Se repite el paso anterior, trasvasando 0,55 ml de un tubo al siguiente.

- Se desechan 0,55 ml del último tubo para que su volumen final sea de 5 ml.

Resultado

  Se consiguen 4 tubos de dilución seriada con razón 1/10 y volumen de 5 ml

El autoclave

  El autoclave es un aparato muy importante en el laboratorio de microbiología, ya que nos permite esterilizar instrumental y sustancias utilizando para ello el vapor de agua a presión.

    Se trata de un instrumento pesado y consistente, ya que debe aguantar las altas presiones que necesitan sus procesos de esterilización. También existen tipos de autoclave que funcionan con óxido de etileno en lugar de vapor de agua.

  El proceso dura normalmente unos 15-20 min. Consiste en introducir el material, teniendo cuidado de no cerrarlo completamente por las altas presiones, y cerrar la tapa hermética para que se ponga en marcha.

  También es conveniente introducir un indicador de esterilización (comúnmente en forma de papel) para cerciorarse de que el proceso se ha realizado satisfactoriamente.

Práctica: Tinción simple

Fundamento

  Se basa en la afinidad del colorante por los diferentes componentes celulares. Estas tinciones se caracterizan por el empleo de un solo colorante.


Material

- Mechero de alcohol
- Asa de siembra redondeada
- Pinzas
- Puente de tinción
- Microscopio
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Cristalizador
- Agua destilada
- Aceite de inmersión
- Pipeta Pasteur
- Colorante: azul de metileno al 1%


Procedimiento

Extensión: Se cogerá una muestra con asa de siembra o hisopo y se hará una suspensión sobre un portaobjetos que previamente tendrá una gota de agua destilada estéril  o suero fisiológico para poder realizar dicha suspensión.

Desecación y fijación: consiste en dejar secar la extensión y fijarla. Se realiza acercando y alejando el portaobjetos de la llama del mechero (con la ayuda de unas pinzas) hasta que la muestra quede seca.

Tinción: colocar el portaobjetos sobre el puente de tinción situado sobre el cristalizador (sobre el que previamente verteremos agua para diluir el tinte cuando lavemos la muestra). Después añadiremos el colorante,  cubriendo por completo la preparación y dejamos que actúe durante 1 min, tras el cual retiraremos el colorante de la extensión inclinando el portaobjetos y dejando que el tinte caída al cristalizador.

Lavado: Con ayuda de una pipeta Pasteur añadimos agua destilada sobre el portaobjetos hasta que el agua salga completamente limpia, dejando resbalar el agua sobrenadante.

Secar: dejamos secar la preparación al aire sobre papel absorbente.

Observación al microscopio: iniciaremos la observación desde los objetivos más bajos 5x, 10x, 40x ó 60x, y por ultimo observaremos a 100 x con aceite de inmersión y colocando un cubre objetos sobre el porta antes de incluir el aceite, para no estropear la muestra.

Práctica: Preparación de colorantes

Fundamento

  Se busca la realización de colorante azul de metileno al 1% para poder utilizarlo cuando sea necesario.


Material

- Embudo
- Pipeta automática
- Agua destilada
- Matraz aforado
- Azul de metileno comercial
- Pipeta Pasteur
- Parafilm


Cálculos

  Ya que partimos de azul de metileno comercial (supongamos 100%), y queremos preparar 50 ml de colorante al 1%:

     1____100
    x_____20

     x=0.2 ml de azul de metileno


Procedimiento

  Cogemos 0,2 ml de azul de metileno con la pipeta y los echamos a un matraz aforado de 50 ml. Luego con ayuda del embudo, echamos agua destilada, y enrasamos hasta el aforo con la pipeta Pasteur. Tapamos el matraz con parafilm y agitamos hasta homogeneizar.

Los líquenes

  Un liquen es el resultado de la simbiosis entre un hongo y un vegetal. Históricamente, los líquenes se habían situado en el reino Plantae, pero de unos años para acá, y dado sus características, muchos científicos los introducen en el reino Fungi.

  Los líquenes son seres pluricelulares que se caracterizan por su gran resistencia a condiciones adversas del medio, y por ello han colonizado gran cantidad de espacios con climas diferentes.

  También son buenos indicadores de contaminación: en los bosques donde haya líquenes significa que el aire esta limpio y exento de contaminación. Por ello no existen líquenes en los espacios cercanos a las ciudades.

Clasificación de las bacterias

  La clasificación de las bacterias según su morfología es una de las más útiles, ya que nos permite la diferenciación de las mismas a simple vista con el microscopio, y sin necesidad de hacer tinciones ni otros procedimientos.

  Así, diferenciamos las bacterias en tres grandes grupos: los cocos, de forma circular; los bacilos, de forma alargada; y los vibriones y espiroquetas, con formas más irregulares.

  Dentro de cada grupo, también se puede diferenciar el microorganismo por la forma en que se agrupa, es decir, la forma de sus colonias (los dibujos que se encuentran bajo los cocos y los bacilos).

Clasificación de los hongos

  Los hongos son uno de los cinco reinos de seres vivos. Aunque existen múltiples clasificaciones, la más utilizada es la siguiente:

  En primer lugar, se dividen en hongos superiores y hongos inferiores. Los primeros son los que no poseen células móviles, pues son los hongos terrestres más evolucionados. Los segundos son de tamaño microscópico y no llegan a fructificar en forma de seta.

  Los hongos superiores se dividen en ascomicetos (levaduras, trufas,..), que son los más numerosos; y basidiomicetos (champiñones, amanitas,...). Los ascomicetos se llaman así por sus esporas, las ascosporas. Los basiodiomicetos se reproducen por basidiosporas y son las setas clásicas y los hongos con sombrero.

  Los hongos inferiores, por su parte, se dividen en oomicófitos o mohos acuáticos, y zigomicófitos (mohos).

Práctica: Esporada

Fundamento

  El estudio de los hongos es muy importante en microbiología, ya que éstos producen multitud de alteraciones en los alimentos y de enfermedades en los seres humanos.
  Una de las técnicas de observación de hongos más utilizada es la esporada, en la que, como su propio nombre indica, se observa las esporas que desprenden las setas tras unas horas en reposo. Así, podremos observar las estructuras características de cada clase de hongo.
  En este caso, la observación la realizamos del hongo Agrocybe aegerita, comúnmente conocida como seta de chopo.

Material

- Ejemplar de Agrocybe aegerita
- Papel de filtro
- Tijeras
- Matraz Erlenmeyer
- Agua

Procedimiento

La toma de muestras de la esporada debe hacerse al lado de la llama del mechero de alcohol, flameando las asas de siembra antes y después de su uso.

Realizaremos la esporada de dos formas:
- La primera consiste en dejar la seta con el sombrero hacia abajo sobre un papel de filtro durante un día. De las esporas que caen sobre el papel, cogemos una muestra con un asa de siembra y la dejamos en un porta junto con una gota de aguan destilada. Le ponemos un cubre y observamos al microscopio.

- La segunda consiste en realizar un agujero en un papel de filtro e introducir la seta por el tallo. Después poner el papel de filtro sobre en matraz Erlenmeyer (con un poco de agua en su interior) con el sombrero por arriba y el tallo dentro del matraz. Al día siguiente recogimos muestra de esporas del papel de filtro y muestra de los gusanos que aparecieron en el tallo y dentro del matraz.

Práctica: Observaciones en fresco

Fundamento

  Las observaciones en fresco se utilizan para muestras demasiado espesas o sólidas, que necesitan ser diluidas para poder estudiar su morfología y movilidad. Para ello debemos partir de cultivos jóvenes o muestras recientes, al tener mayor número de microorganismos vivos.
  La movilidad se manifiesta por un desplazamiento de los microorganismos en todas las direcciones del campo de visión del microscopio, a diferencia del movimiento browniano de los gérmenes muertos, que no presentan movilidad y se desplazan todos ellos en la misma dirección por las corrientes de fluidos.


Material

- Portaobjetos (normales y excavados)
- Microscopio
- Triquinoscopio
- Lupa
- Mechero de alcohol
- Cubreobjetos
- Asa de siembra
- Agua destilada
- Muestras de Gymnorhynchus gigas (gusano en una seta) ,de las setas, y de agua estancada


Procedimiento

Ø Método de cámara húmeda:

Flameamos el asa de siembra con el mechero hasta que el alambre este incandescente.

Cogemos un vaso de precipitados con agua destilada, introducimos el asa de siembra y recogemos suero para pasarlo al portaobjetos. Repetiremos el proceso un par de veces, hasta tener una gota de suero considerable para poder hacer una extensión.

Flameamos de nuevo el asa de siembra redondeada con el mechero hasta que se ponga incandescente el alambre. Dejamos enfriar al aire o tocando otra zona de la muestra para que la alta temperatura no dañe el trozo que vamos a tocar.

Tocamos suavemente con el asa de siembra una zona de la muestra.

A continuación, ponemos en contacto el asa de siembra con la gota de suero fisiológico estéril que está en el portaobjetos y la extendemos por el porta mientras homogenizamos con el asa la muestra para realizar la suspensión.

En el caso de ser liquido ponemos directamente dos gotas de medio en el porta, ponemos un cubre y observamos.

Pondremos un cubre objetos sobre la muestra y observaremos al microscopio con objetivo de 40x o 60x dependiendo del microscopio.

Ø Gota pendiente.

Cogemos un cubreobjetos y con el asa de siembra redondeada cogeremos una gota de suspensión y la depositamos en el centro. (Realización de la suspensión igual que en el método de cámara húmeda)

Colocar sobre él un portaobjetos excavado invertido y untado con vaselina solida alrededor de la excavación para asegurarnos la unión entre ambos.

 Damos la vuelta, de forma que el cubreobjetos quede arriba y observaremos al microscopio con el objetivo 40x o 60x, dependiendo del microscopio.

Triquinoscopio y lupa

Observamos el agua, los gusanos y demás muestras sin ningún tratamiento previo. Con la lupa vemos las muestras con mayor aumento que a simple vista, y con el triquinoscopio aún más, aunque no tan ampliadas como en el microscopio óptico.

Práctica: El microscopio

Fundamento

 Como sabemos, casi todos los organismos que se estudian en microbiología, no se observan a simple vista por ser demasiado pequeños. Esto fue un gran impedimento hasta que en el siglo XVII  Anton van Leeuwenhoek inventó el primer microscopio. Este instrumento funciona mediante lentes de aumento que amplían la imagen. Los microscopios de hoy en día son tan potentes que incluso pueden ampliarla millones de veces.

  El microscopio más utilizado en microbiología es el microscopio óptico. Con él se pueden observar bacterias, mohos, levaduras, tejidos,.. Y gracias a las tinciones, tambien sus diferentes componentes y sus procesos.

Objetivo

Aprender a utilizar el microscopio, conocer sus partes, su manejo y su mantenimiento.

Material

- Microscopio

- Pañito

- Papel de filtro

- Porta con muestra y cubre

Procedimiento

  Como he dicho antes, funciona con la ampliación de una serie de lentes, unas en los oculares y otras en los objetivos. Las diferentes partes del microscopio son:

  Para utilizar el microscopio, a grandes rasgos, colocaremos la muestra en un portaobjetos, cubriéndola con un cubreobjetos. Luego la situaremos en la platina, sujetándola con las pinzas. Encenderemos el microscopio y situaremos la muestra en el centro del haz de luz del foco, y con el condensador elegiremos la luz que necesitamos. Después ajustaremos el objetivo de menor aumento y, mirando por los oculares y utilizando el tornillo macrométrico, ajustaremos hasta que se observen los objetos. Después enfocaremos con el tornillo micrométrico. Iremos cambiando los objetivos girando el revólver con cuidado y volviendo a enfocar. Si queremos utilizar el objetivo de inmersión, deberemos aplicar una gota de aceite de inmersión al cubre antes.

Hay que cuidar el microscopio!

  El microscopio es una máquina compleja y cara, que debe durarnos muchos años, por lo que su mantenimiento es fundamental. Debemos desenchufarlo siempre que no lo estemos utilizando, y cada vez que terminemos una práctica (y si es necesario al empezar también) limpiaremos los objetivos y los oculares con un pañito y papel de filtro. También deberemos tener mucho cuidado al trasladarlo, ya que un golpe lo podría estropear, o rompernos el pie.

Material de laboratorio de microbiología

  En el laboratorio de microbiología se encuentra, por supuesto, el material general de laboratorio, que incluye:
- Mobiliario, como mesas, sillas,,,
- Máquinas, como el autoclave, las estufas, los microscopios,..
- Pequeño material, como pipetas, probetas, tubos de ensayo,...

  No obstante, en esta entrada se centra en el material específico de microbiología, del cual explicaremos el más utilizado:

- Mechero Bunsen

- Mechero de alcohol (más utilizado)

- Estufa de incubación

- Microscopio óptico

- Campana de seguridad

- Contador de colonias

- Asas de siembra

- Placas de Petri

- Pipetas

- Asas de Digralsky

- Portas y cubres

Seguridad en el laboratorio de microbiología

  En todo puesto de trabajo existen unos riesgos, en mayor o menos medida, de sufrir un accidente laboral o una enfermedad derivada del trabajo. En el laboratorio de microbiología se trabaja constantemente con microorganismos patógenos que no sólo contaminan los alimentos, si no también producen enfermedades en el ser humano.
  Para prevenir el contagio de microorganismos, se debe trabajar con un protocolo de seguridad estricto. Algunas de las normas de seguridad son:

- Entrar al laboratorio de forma ordenada, dejando los objetos personales en la taquilla exterior.
- Llevar puesta la bata de laboratorio, cerrada, en todo momento.
- Mantener las superficies de trabajo limpias y desinfectadas.
- Lavar las manos con frecuencia durante las prácticas, y antes de salir del laboratorio.
- Evitar llevar joyas y pulseras.
- Llevar el pelo recogido.
- No comer, beber ni fumar.
- No devolver los sobrantes de los reactivos a su frasco.
- No pipetear con la boca.
- Utilizar guantes.
- Trabajar en la campana o cerca del mechero.

  Cada laboratorio debe disponer de la documentación de seguridad, tanto de las normas, como de las actuaciones en caso de accidente, y todos los empleados del laboratorio deben estar al tanto de qué hacer.

Ciclo biológico

  Un ciclo biológico es un esquema que representa la forma en que un parásito pasa su vida (nace, crece, se alimenta y muere) y la forma en que infecta al hospedador y cómo se transmite de unos organismos a otros. Conocer el ciclo de un parásito es crucial para comprender la forma en que la infección se adquiere y se disemina, la patogénesis de la enfermedad y la manera en que podría ser controlada.
  Un ejemplo de ello es el ciclo del Trypanosoma cruzi, responsable de la Enfermedad de Chagas en humanos:

  El T. cruzi pasa la mitad de su vida en el intestino del triatomino, un insecto que le sirve de vector, ya que transmite el parásito al humano a través de su picadura. Dentro del insecto el parásito se encuentra de forma latente, pero al entrar al cuerpo del ser humano comienza su multiplicación, causando al infectado una grave enfermedad.

Clasificación de los parásitos

  Los parásitos son los animales que, como su propio nombre indica, establecen una relación de parasitismo con el organismo al que hospedan. El parasitismo consiste en que estos seres viven a expensas de su huésped, causándole daño y provocándole enfermedades.
 Como ocurre con los seres vivos y con muchas otras clasificaciones, van modificándose con el tiempo y existen multitud de teorías coetáneas. Para esta entrada he utilizado la siguiente:

  Para empezar, los parásitos se clasifican en protozoos (unicelulares) y metazoos (pluricelulares).

  Los protozoos, por su parte, se subdividen en cuatro grupos atendiendo a su medio de locomoción: amebas (pseudópodos), flagelados (flagelos), ciliados (cilios) y esporozoos (estáticos).

  Por otra parte tenemos los metazoos, que se componen de los helmintos y los artrópodos.

  Los helmintos son, básicamente, gusanos, y pueden ser: céstodos (planos), tremátodos (duelas) y nemátodos (redondos).

  Y para terminar, en el grupo de los insectos se encuentran los insectos, los arácnidos, los crustáceos y los miriápodos.

Clasificación de los organismos vivos

  A lo largo de la historia y con el avance de la ciencia, se han realizado multitud de clasificaciones de los seres vivos. La más generalizada es la de los 5 reinos: Plantas, Animales, Hongos, Algas y Bacterias

  Los animales, el reino al que los seres humanos pertenecemos, se subdivide a su ves en vertebrados e invertebrados, y a su vez en varios subtipos. Son seres pluricelulares y heterótrofos.

  Las platas son el segundo reino. Son seres autótrofos y constituyen la base para la vida del reino animal, tanto como nutrientes como proporcionándole oxígeno a la atmósfera.

  Los hongos son un reino heterogéneo, pueden ser pluri o unicelulares. Se dividen básicamente en hongos, mohos y levaduras.

  Las algas, tradicionalmente incluido en el reino Plantae, y compartiendo características comunes.

  Por último las bacterias, objeto de estudio junto con los hongos en microbiología de los alimentos, tanto por su carácter microscópico como por su patogeneidad. Grupo muy amplio con diversas formas de nutrición, metabolismo, reproducción,...

Clasificación de los microorganismos

  El estudio de los microorganismos y su clasificación son complejos dado su enorme número de especies y su heterogeneidad. Hay muchas clasificaciones, en este caso utilizaremos la que existe desde el punto de vista sanitario. Así, los microorganismos se dividen en:

1. Deterioradores: alteran las características organolépticas del alimento. Ej: fermentadores
2. Patógenos: causan enfermedades. Ej: E. coli
3. Indicadores: sugieren malas prácticas sanitarias. Ej: S. aureus
4. Iniciadores: controlan el comienzo de los procesos de fermentación. Ej: L. bulgaricus
5. Indiferentes: flora normal del alimento. Ej: L. mesenteroides

Cadena epidemiológica

  La cadena epidemiológica es el conjunto de factores que hacen posible una infección, es decir, que permiten que un microorganismo patógeno colonice un organismo y, por consiguiente, se produzca la enfermedad.

  El agente causal específico es el microorganismo causante de la enfermedad (bacteria, virus, hongo,...). El modo de transmisión depende de cada patógeno y puede ser de muchas formas: aire, agua, contacto, insectos,...

  La puerta de entrada y la susceptibilidad del huésped dependen de su higiene, su estado de salud, su edad,...

  Si la cadena se repite, la enfermedad seguirá transmitiéndose entre los individuos.