Práctica: Tinción de Gram

Fundamento:
 
  La tinción de Gram es la prueba de reconocimiento de microorganismos por excelencia. Esta separa las baterias en dos grandes grupos: Grampositivas (en azul) y Gramnegativas (en rojo).


Material:

- Microscopio
- Muestra (en este caso S. aureus)
- Mechero de alcohol
- Asa de siembra
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Cristalizador
- Puente de tinción
- Pipeta Pasteur
- Vaso de precipitados


Reactivos:

- Cristal violeta
- Lugol
- Safranina
- Etanol al 95%


Procedimiento:

1. Hacer un frotis tomando una muestra de la colonia y mezclándola con una gota de agua destilada en un portaobjetos.
2. Secarlo al aire o con la llama del mechero
3. Cubrir la extensión con cristal violeta y dejar 3 minutos en el puente de tinción
4. Deslavar con cuidado con agua destilada con la ayuda de una pipeta Pasteur
5. Cubrir la extensión con lugol y dejar 1 minuto
6. Deslavar con agua destilada
7. Deslavar la extensión con etanol
8. Cubrir la extensión con safranina y esperar 2 minutos
9. Deslavar con agua destilada
10. Observar al microscopio


Resultados:

S. aureus es grampositivo, por lo que queda teñido de azul

Staphylococcus aureus

  El Staphylococcus aureus es una bacteria grampositiva, anaerobia facultativa, productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada.

  Es una bacteria muy común en los seres humanos, aunque no siempre causa infección: sólo coloniza al individuo, pasando a formar parte de su microbiota normal.

  Pero a veces puede proliferar de más o invadir otras zonas en las que no se encuentra naturalmente, causando una amplia gama de enfermedades, desde cutáneas leves a enfermedades muy serias como meningitis o sepsis. Además, es resistente a la penicilina.

  También puede causar enfermedades no sólo con su presencia y proliferación, si no a través de su enterotoxina estafilocócica.

Práctica: Observación de levaduras al microscopio

Fundamento:

  Las levaduras son seres microscópicos, que junto con los hongos y los mohos componen el reino Fungi. En esta práctica trataremos de crear unas condiciones adecuadas para el crecimiento de una levadura, para posteriormente observarlo al microscopio.

Material:

- Levadura
- Agua
- Azúcar
- Asa de siembra
- Placa de Petri
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Microscopio

Procedimiento:

1. Mezclar la levadura con el agua y el azúcar
2. Reposar 5-10 minutos
3. Observar al microscopio

Resultado:

Clasificación bacteriana según su relación con el oxígeno

Esta clasificación nos sirve en microbiología para el reconocimiento de microorganismos, ya que a la hora de incubar las muestras, deberemos elegir si crear un ambiente anaerobio o no. Si la respuesta es positiva, recurriremos a la jarra de anaerobiosis:

Práctica: Dilución seriada

Fundamento
  
  Las diluciones seriadas son bancos de diluciones en las que la sustancia a disolver se va trasvasando de tubo a tubo hasta conseguir la dilución deseada. Este procedimiento es útil en las pruebas de anticuerpos, de reconocimiento, y otras muchas pruebas microbiológicas.

Material

- Matraz aforado de 100 ml
- 4 tubos de ensayo
- Micropipeta con varias boquillas
- Agitador
- Agua destilada
- Azul de metileno
- Gradilla
- Pipeta de 5 ml



Cálculos

Primeramente se hace un esquema del banco de diluciones seriadas:

  A continuación, mediante la fórmula del factor de dilución hallamos la concentración final de cada tubo, y mediante la fórmula de diluciones seriadas hallamos el volumen que hay que trasvasar de tubo a tubo, y el volumen que hay que desechar del último (la misma cifra)

Procedimiento

- En una gradilla se colocan los cuatro tubos de ensayo.

- Se echan con una pipeta 5 ml de agua destilada en cada tubo.

- Con la micropipeta se trasvasan 0,55 ml de la disolución madre al tubo 1 (se debe cambiar la punta de la pipeta al trasvasar a cada tubo). Después se homogeneiza el tubo con el agitador.

- Se repite el paso anterior, trasvasando 0,55 ml de un tubo al siguiente.

- Se desechan 0,55 ml del último tubo para que su volumen final sea de 5 ml.

Resultado

  Se consiguen 4 tubos de dilución seriada con razón 1/10 y volumen de 5 ml

El autoclave

  El autoclave es un aparato muy importante en el laboratorio de microbiología, ya que nos permite esterilizar instrumental y sustancias utilizando para ello el vapor de agua a presión.

    Se trata de un instrumento pesado y consistente, ya que debe aguantar las altas presiones que necesitan sus procesos de esterilización. También existen tipos de autoclave que funcionan con óxido de etileno en lugar de vapor de agua.

  El proceso dura normalmente unos 15-20 min. Consiste en introducir el material, teniendo cuidado de no cerrarlo completamente por las altas presiones, y cerrar la tapa hermética para que se ponga en marcha.

  También es conveniente introducir un indicador de esterilización (comúnmente en forma de papel) para cerciorarse de que el proceso se ha realizado satisfactoriamente.

Práctica: Tinción simple

Fundamento

  Se basa en la afinidad del colorante por los diferentes componentes celulares. Estas tinciones se caracterizan por el empleo de un solo colorante.


Material

- Mechero de alcohol
- Asa de siembra redondeada
- Pinzas
- Puente de tinción
- Microscopio
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Cristalizador
- Agua destilada
- Aceite de inmersión
- Pipeta Pasteur
- Colorante: azul de metileno al 1%


Procedimiento

Extensión: Se cogerá una muestra con asa de siembra o hisopo y se hará una suspensión sobre un portaobjetos que previamente tendrá una gota de agua destilada estéril  o suero fisiológico para poder realizar dicha suspensión.

Desecación y fijación: consiste en dejar secar la extensión y fijarla. Se realiza acercando y alejando el portaobjetos de la llama del mechero (con la ayuda de unas pinzas) hasta que la muestra quede seca.

Tinción: colocar el portaobjetos sobre el puente de tinción situado sobre el cristalizador (sobre el que previamente verteremos agua para diluir el tinte cuando lavemos la muestra). Después añadiremos el colorante,  cubriendo por completo la preparación y dejamos que actúe durante 1 min, tras el cual retiraremos el colorante de la extensión inclinando el portaobjetos y dejando que el tinte caída al cristalizador.

Lavado: Con ayuda de una pipeta Pasteur añadimos agua destilada sobre el portaobjetos hasta que el agua salga completamente limpia, dejando resbalar el agua sobrenadante.

Secar: dejamos secar la preparación al aire sobre papel absorbente.

Observación al microscopio: iniciaremos la observación desde los objetivos más bajos 5x, 10x, 40x ó 60x, y por ultimo observaremos a 100 x con aceite de inmersión y colocando un cubre objetos sobre el porta antes de incluir el aceite, para no estropear la muestra.